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Diagnose von Viruskrankheiten im Rahmen der Anerkennung von Anbaumaterial von Kernobst und Entwicklung von Verfahren zur Gesunderhaltung von zertifiziertem Material in Reisermuttergärten und Unterlagenbaumschulen

Jakovljevic, Vladimir and Jelkmann, Wilhelm (2015) Diagnose von Viruskrankheiten im Rahmen der Anerkennung von Anbaumaterial von Kernobst und Entwicklung von Verfahren zur Gesunderhaltung von zertifiziertem Material in Reisermuttergärten und Unterlagenbaumschulen. [Diagnosis of virus diseases within certificatioin of pome fruit and development of strategies for maintaining the health status of certified basic material and rootstocks.] Julius Kühn-Institut, Institut für Pflanzenschutz in Obst- und Weinbau, D-Dossenheim .

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PDF - German/Deutsch (Teilschlussbericht)
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Summary

Im Projekt wurden verschiedene Methoden getestet um Fruchtvirosen und mit Apple rubbery wood (ARW) bzw. die Gummiholzkrankheit an Apfel und anderem Kernobst zu entdecken und mittels Labortests zu diagnostizieren. Hierzu wurden mit Kleeseide-Arten (Cuscuta) Übertragungsversuche auf krautige Pflanzen (N. occidentalis) durchgeführt. Hierbei konnten weder Symptome auf N. occidentalis beobachtet werden, noch gelang es pathogenspezifische Nukleinsäuren zu ermitteln. Negativ verliefen auch Versuche zum unspezifischem Nachweis von zirkulären DNA Viren mittels Rolling circle amplification. Da diese Versuche keinen Hinweis auf ein mögliches Pathogen ergaben, wurden erhebliche Teile der weiteren Arbeiten auf Hochdurchsatzsequenzierung (NGS) von ARW und zu Mischinfektionen latenter Apfelviren durchgeführt. Hierbeit wurden neue Protokolle zur Extraktion von Nukleinsäuren im Rahmen der Optimierung von NGS Probenvorbereitungen etabliert.
In NGS von ARW Proben wurden zu Ende des Projektes und in internationaler Zusammenarbeit mit einem Wissenschaftler der CFIA in Kanada zwei den Phleboviren nahe Verwandte Viren der Familie der Bunyaviridae als potenzielle ARW-assoizierte Viren aufgefunden. Diese Viren wurden vorläufig als ARWaV-1 und ARWaV-2 bezeichnet. Umfangreiche PCR Tests laufen derzeit in Dossenheim und bei CFIA in British Columbia, Kanada, um die Assoziation mit der ARW zu verifizieren und geeignete Primer zu entwickeln. Zudem werden ab 2017 in Dossenheim umfangreiche Indikatortests im Freiland mit ARW Quellen aus Europa und Kanda aufgenommen.
NGS Datenanalysen zeigten Änderungen in der Expression von Genen für die Ligninbiosynthese und von einigen miRNAs mit genregulatorischer Funktion. Um eine Verbindung dieser Änderungen in der Genxpression zu ARW Pathogenese zu prüfen, sind weitere Analysen mit meheren ARW Isolaten erforderlich. Die bioinformatischen Analysen von NGS Daten aus Mischinfektionen latenter Apfelviren identifizierten eine hohe Variabilität sowie neue Stämme von ASPV, ASGV und ACLSV. Einige dieser Stämme konnten mittels PCR nachgewiesen werden. Weitere Verbesserungen an PCR-basierten diagnostischen Arbeiten sind erforderlich.
Versuche zur Optimierung der Kloningtechniken für infektiöse Vollängenklone wurden mit Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV) erfolgreich fortgesetzt. Mit Vakuuminfiltration konnte eine kostengünstige neue Methode zur Inokulation von Apfelsämlingen mit viralen infektiösen ACLSV cDNA Klonen entwickelt werden.

Summary translation

In the project different methods were investigated to identify viral agents associated with fruit disorders and rubbery wood (ARW) of apple and other pome fruit. To achieve this goal Cuscuta transmission trials from apple to Nicotiana occidentalis were performed. However, no specific symptoms were observed on herbaceous host plants, nor was it possible to indentify pathogen specific nucleic acids. Rolling circle amplification experiments, which would allow detection of circular DNA viruses, remained without a positive result. Since these experiments did not identify a potential pathogen associated with ARW or mixed infections with latent viruses in apple, next generation sequencing (NGS) was initiated. Initially, protocols for nucleic acid extraction from apple tissue were optimized for NGS. In international cooperation with a scientist from CFIA in Canada two viruses closely related to Phleboviruses and distantly related to members of the Bunyavirales were identified in NGS as potential causal agent(s) of ARW. The viruses were designated ARWaV-1 and ARWaV-2. Currently, extensive PCR tests were initiated in Dossenheim and at CFIA in British Columbia, Canada, to verify the association with ARW and to develop suitable primers for detection. In addition, comprehensive woody indexing has been started in field trials at the JKI Dossenheiim with ARW sources from Europe and Canada.
NGS data analysis suggested modifications in the expression of genes for lignin biosynthesis and of miRNAs with gene regulatory function. To test connections of these modifications for gene expression in ARW pathogenesis, further analysis with additonal ARW isolates will be necessary. The bioinformatic analysis of the NGS data of mixed infections with latent viruses of apple identified high variabilty and new strains of Apple stem pitting virus (ASPV), Apple stem grooving virus (ASGV) and Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV). Some of these strains could be identified by PCR. There is a further need for improvements of primers for PCR based diagnosis of these viruses.
Optimization experiments of cloning methods for generating infectious full-length cDNA clones were successful with ACLSV. A vaccum infiltration method was developed as new and cost efficient method to inoculate apple seedlings with ACLSV infectious full-length cDNA clones.

EPrint Type:Report
Keywords:BÖLN, BOELN, BÖL, BOEL, FKZ 12NA019, FKZ 12NA049, Reiserschnittgarten, Gummiholz, apple rubbery wood, Apple stem pitting virus, Apple stem grooving virus, Apple chlorotic leafspot virus, apple proliferation, virus detection
Subjects: Crop husbandry > Production systems > Fruit and berries
Crop husbandry > Crop health, quality, protection
Research affiliation: Germany > Federal Organic Farming Scheme - BOELN > Plants > Pflanzenschutz
Germany > Federal Research Centre for Cultivated Plants - JKI > Institute for Plant Protection in Fruit Crops and Viticulture
Related Links:http://www.bundesprogramm.de, http://orgprints.org/cgi/search/advanced?addtitle%2Ftitle=&keywords=12NA019&projects=BOEL&_order=bypublication&_action_search=Suchen, http://orgprints.org/id/saved_search/1487
Deposited By: Jelkmann, Prof. Dr. Wilhelm
ID Code:32108
Deposited On:11 Sep 2017 11:05
Last Modified:11 Sep 2017 11:05
Document Language:German/Deutsch
Status:Unpublished
Refereed:Not peer-reviewed
Additional Publishing Information:Gefördert durch das Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages im Rahmen des Bundesprogramms Ökologischer Landbau und andere Formen nachhaltiger Landwirtschaft.
Projektleitung: Prof. Dr. Wilhelm Jelkmann, Julius Kühn-Institut, Institut für Pflanzenschutz in Obst- und Weinbau
Bei dem hier eingestellten Schlussbericht handelt es sich um einen Teilschlussbericht im Rahmen eines Verbundvorhabens.
Der Teilschlussbericht des Verbundpartners FKZ 12NA049 kann im Volltext unter http://orgprints.org/32109/ heruntergeladen werden.

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